1、三級安全柜使用時首先用遙控器開啟隔離窗，窗體警報器隨即響起，當窗體向上滑動到合適的工作高度時，警報聲解除，即可開始工作。
2、三級安全柜內不放與本次實驗無關的物品，操作前應將實驗所需的全部物品移入安全柜（工作用紙，小鼠墊料等易吹起的物品不許放在生物安全柜內以免阻塞回風隔 柵），避免操作中雙臂頻繁穿過氣幕破壞氣流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，消毒工作臺面。柜內物品擺放應做到清潔區、半污染區與污染區分開，在 柜內擺放的物品應該盡量呈橫向一字擺開，操作中物品取用方便，避免回風過程中造成交叉污染。物品應盡量靠后放置，但不得擋住氣道口，以免干擾氣流正常流動。
3、打開風機5～10分鐘，待柜內空氣凈化并氣流穩定后再進行實驗操作。將雙臂應該垂直地緩緩伸入安全柜內，至少靜止1分鐘，使柜內氣流穩定后再進行操作，柜 內操作時手應該盡量平緩移動。操作中如確實需要拿出手臂或物品進入，也應垂直地緩緩進出，且可能接觸感染物品，要對手套及手臂進行表面消毒；
4、避免震動原則：柜內盡量避免震動儀器（例如離心機、旋渦振蕩器等）的使用，因為震動會使得積留在濾膜上的顆粒物質抖落，導致操作室內部潔凈度降低，同時如 果在前操作面平衡失敗還會引起安全柜對操作者的污染。如必須則放置在靠近柜內后壁1/3處，潔凈的物品應放置在距離產生氣溶膠器皿至少150mm外。
5、不同樣品柜內移動原則：操作和移動物品時應按照從清潔區（低污染性物品）到污染區（高污染性物品）進行，以避免交叉污染。為防可能濺出的液滴，可在臺面上鋪一用消毒劑浸泡過的毛巾或紗布，但不能覆蓋住安全柜格柵。
6、三級安全柜內操作期間，嚴禁使用酒精燈等明火，以避免產生的熱氣流干擾柜內氣流穩定；且明火使用過程中產生的細小顆粒雜質將被帶入濾膜區域，這些高溫 雜質會損傷HEPA濾膜。無法避免一定需要使用的時候，宜使用低火苗的本生燈。允許使用微型電加熱器或紅外滅菌器，使用一次性無菌接種環；
7、工作時盡量減少背后人員走動以及快速開關房門，以防止安全柜內氣流不穩定。
8、在實驗操作時，不可打開玻璃視窗，應保證操作者臉部在工作窗口之上。操作盡量工作臺中央，稀釋病毒樣本必須在生物安全柜中,不可吹打,在旋渦混勻器上混勻,吹打產生的氣溶膠極易造成整個試驗環境的污染；將盛有樣品的試管或試盤的表面密封以防止下沉氣流侵襲樣品。
9、三級安全柜應定期進行檢測與保養，以保證其正常工作。工作中一旦發現安全柜工作異常（例如持續氣流報警，表明安全柜的正常氣流模式受到了干擾，操作者或物品當即處于危險狀態），應立即停止工作，采取相應處理措施，并通知P2管理員。
10、允許全天24小時工作。連續工作有助于控制實驗室中灰塵和顆粒的水平；推薦將安全柜一直維持運行狀態。工作*后，關閉玻璃窗，保持風機繼續運轉10～15分鐘，同時打開紫外燈，照射30分鐘。
11、要丟棄的、污染的物品應暫時放在安全柜的后部；操作過程中避免將要丟棄的物品放到安全柜外的容器內。包括廢棄物袋、盛放廢棄吸管的盤子以及吸濾瓶等體積較 大的物品，應放在某一側不能拿出安全柜；將所有需要丟棄的物品放入黃色生物安全袋或廢棄物容器內，嚴密封口后方可拿出；柜內使用的物品應在表面消毒后再取 出，以防止將病原微生物帶出而污染環境。
12、三級安全柜應定期進行清潔消毒，柜內臺面污染物可在工作完成且紫外燈消毒后用2%的84消毒液擦拭。也可用70%酒精并對工作臺面、后壁、側壁, 觀察窗的內側進行消毒；柜體外表面則應每天用1%的84消毒液擦拭。甲醛蒸汽熏蒸是清除污染常用的方法。
